CCK8檢測的試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】。它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
一、CCK8檢測的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔按 4×103個(gè)接種至 96 孔板中，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含 10ｕL的毒性檢測液CCK8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后，用酶標(biāo)儀測波長為450 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次， 取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按公式計(jì)算生長抑制率＝[(對照組 OD－實(shí)驗(yàn)組 OD)/對照組 OD] ×100%，以分組為橫坐標(biāo)，生長抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長抑制率柱狀圖。
當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的較小接種量至少為1000 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。酚紅和血清對CCK8法的檢測不會(huì)造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
二、CCK8檢測的注意事項(xiàng)
CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板較外一圈的孔較容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，較外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。
