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一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）說明書

One Step Western Kit HRP（Mouse）

目錄號：  K2030     

保   存：  2 - 8  ℃，避免冷凍

組分說明

Cat. No.           K2030          K2030A        K2030B

Kit Size              10           2             50

封閉液               125 ml        30 ml         500 ml

抗體反應(yīng)液            HRP（鼠）     1 ml         200  μl      5×1 ml

抗體稀釋液            125 ml        30 ml        500 ml

漂洗液（10×）        125 ml        30 ml         500 ml

產(chǎn)品簡介

      一步法快速WB 試劑盒（鼠）是上海研謹(jǐn)生物xin推出的Western  Blot 檢測試劑盒，能夠在1 小時左右得到高質(zhì)量的 Western Blot 結(jié)果，且操作簡便、檢測靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)。常規(guī)的Western Blot 間接 法檢測過程（封閉、一抗結(jié)合和二抗結(jié)合）需要較長的時間，實驗流程復(fù)雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到載體膜上后，使用試劑盒中的封閉液孵育5 min，再用抗體反應(yīng)液處理后的一抗孵育載體膜，經(jīng)洗滌三次（每次5  分鐘）后，即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測。本試劑盒針對目的蛋白一抗為鼠來源的實驗系統(tǒng)使用。

注意事項

 1.  客戶自己準(zhǔn)備鼠來源的一抗。

 2.  使用封閉液、抗體稀釋液（鼠）、漂洗液之前請充分混勻。

 3.  漂洗液如在2-8  ℃保存時出現(xiàn)沉淀，請恢復(fù)到室溫，把沉淀溶解后正常使用，1×漂洗液可在室溫保存一個月。

 4.  建議轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅等試劑染色，并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效率。

 5.  一抗和抗體反應(yīng)液HRP（鼠）需要通過預(yù)實驗來確定jia的稀釋用量。

 6.  抗體反應(yīng)液HRP（鼠）、抗體稀釋液和抗體用量可根據(jù)膜的大小按比例放大或減少。

 7.  加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復(fù)使用一次。特異性及親和力不好的抗體建議不重復(fù)回收使用。回收后抗體如在1-2天內(nèi)使用放置在2-8  ℃，長期保存請在-20℃凍存，避免多次反復(fù)凍融。

 8.  如果存在較高背景的情況，請調(diào)整抗體的用量，并增加洗膜次數(shù)。

 9.  試劑盒內(nèi)所有試劑請于2-8  ℃保存，避免凍融。

 操作步驟

 本產(chǎn)品適用于轉(zhuǎn)膜完成后的封閉及抗體孵育步驟，以5 cm×8 cm  膜為例：

 1.  漂洗液準(zhǔn)備：取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml，待用。每次洗膜用8-10 ml。

 2.  轉(zhuǎn)膜完成后，將膜浸沒到10 ml封閉液中，室溫封閉5分鐘。

 3.  倒掉封閉液，加入8-10 ml 1×漂洗液，于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。

  4.  洗膜的同時可準(zhǔn)備抗體孵育液：取抗體反應(yīng)液HRP（鼠）100μl到EP管中，加入鼠源一抗3-10μg，槍頭吸打至充分混勻，室溫孵育5分鐘。

  5.  將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP（鼠）混合液加入到10 ml  抗體稀釋液中，充分混勻。

   注意：1）一抗的用量也可根據(jù)抗體的稀釋度來進(jìn)行調(diào)整。以抗體的終稀釋度1:1000為例，取100μl抗體反應(yīng)液HRP（鼠）到EP管中，加入10μl一抗，加入到10 ml  抗體稀釋液中，充分混勻，室溫孵育5分鐘。

2）如果膜面積較小，可按比例減少抗體、反應(yīng)液及稀釋液的用量。

6.  步驟3中，洗膜完成后，倒掉漂洗液，將一抗、反應(yīng)液及稀釋液混合而成的抗體孵育液加到膜上（確保孵育液*浸沒膜表面），在搖床上以適當(dāng)速度室溫孵育40分鐘。

  7.  棄去（回收）抗體稀釋液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分鐘。

  8.  進(jìn)行后續(xù)檢測。建議采用ECL或者沉淀型TMB法進(jìn)行檢測。

應(yīng)用實例

A:  普通WB對照：beta-actin鼠單抗（YJ0096）5ug室溫孵育40min，洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

（YJ0102）1：10000稀釋，室溫40min，ECL（YJ0049）曝光

B:  一步法WB： beta-actin鼠單抗（YJ0096）5ug 室溫孵育40min ，ECL（YJ0049）曝光

實例一  抗原為         293T 細(xì)胞全裂解液（YJ0065） 

 C：普通 WB 對照：GST 鼠單抗（K0084）2.5ug 室溫孵育40min，洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

（K0102）1：10000 稀釋，室溫40min，ECL（K0049）曝光。

D：一步法WB：  GST 鼠單抗（K0084）2.5ug  室溫孵育40min ，ECL（K0049）曝光。

實例二  抗原為         E.coli 多標(biāo)簽蛋白裂解液（K2016） 

常見問題及解決辦法  

問題：信號太弱或者看不到條帶                                                      

可能原因：

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉(zhuǎn)膜效率太低

c一抗親和力較低

解決方案：  

A 進(jìn)行SDS-PAGE電泳時加大上樣量。

B 優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時間或者電流，確保轉(zhuǎn)膜時膜與膠之間沒有氣泡。  

C 增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育時間。 增加抗體濃度可

   以增加信號。

D 對于低親和力抗體來說，減少洗膜時間可以增加信號。由每次10min，減少到每次5min     可以增加信號。  

問題：背景偏高

可能原因：

a 一抗使用過量                      

b一抗有非特異性結(jié)合或者與封閉試劑有交叉反應(yīng)     

c洗膜時間太短

d曝光顯影時間過長

e容器或者試劑被污染

解決方案：

A  減少一抗的使用量，相應(yīng)的減少WB-1用量。

B  使用 pretreat A-b（M01052）?？蛻暨€可以使用 Quick Block Optimization kit 來找到j(luò)ia的封閉試劑。

C  增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。

D  減少曝光時間。如果信號和背景都高，可以等待一段時間，等背景信號減弱后，再進(jìn)行  曝光。

E  每次洗滌的時候使用清潔的容器。帶手套，使用清潔的鑷子處理膜。

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